CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).

¿Qué es HPLC?

      La cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography (HPLC) es una técnica de separación analítica que se encuentra basada en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases (estacionaria y móvil)  inmiscibles mediante la afinidad que presenta el compuesto o analito por dichas fases.

¿Cómo  surgió y logró esta técnica a presentar una gran eficacia?

      La disminución del tamaño de las partículas de la fase estacionaria hasta el tamaño de los micrones creó la necesidad de utilizar altas presiones para que se logre que fluya la fase móvil, de esta manera surgió la cromatografía de alta eficacia, la cual hace que sea distinta a las demás técnicas debido a que se debe de trabajar a altas presiones y por tal motivo presenta una gran eficacia en la hora de realizar separaciones.

¿En qué área nos puede servir?

      Como se trata de un tipo de cromatografía en columna, este método es utilizado frecuentemente en bioquímica y química analítica.

Toda técnica cromatográfica posee:

1.       Una fase estacionaria.

2.       Una fase móvil.

3.       La nuestra.

¿En qué consiste?

      Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil.

·         La fase estacionaria es sílica.

·         La fase móvil actúa de portador de la muestra.

La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna.

      Dicho brevemente, la separación cromatográfica de líquidos HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria.

Aplicaciones

      Método para la separación  de compuestos dependiendo del área en que se desee obtener, a continuación se exponen algunos ejemplos:

En bioquímica:

·         Aminoácidos y macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos).

En química y farmacia:

·         Fármacos, esteroides y antibióticos.

En toxicología:

·         Plaguicidas.

En química orgánica:

·         Compuestos semivolátiles, hidrocarburos y  especies organometálicas.

En química inorgánica:

·         Una variedad de sustancias inorgánicas.

Tipos de muestras

·         Aguas.

·          Suelos.

·         Alimentos.

·         Extractos

·         Otros. 

Tipos de cromatografía en HPLC

Se clasifican de acuerdo con el mecanismo de separación:

·         De adsorción Superficial: la fase estacionaria es sólida. Para obtener la separación debemos tener diferencias de solubilidad y retención por absorción  en la fase estacionaria. Las fases estacionarias más comunes son la de sílice y alúmina.

·         De partición: en donde  las fases móvil (líquida) y estacionaria  no pueden mezclarse. La separación se basa en la distribución de solutos.

·         De intercambio Iónico: las fases (estacionaria y móvil) son de la misma naturaleza (iónica), en donde los iones de la fase estacionaria deben de tener cargas opuestas al  eluyente.

·         De Exclusión por tamaño o de permeabilidad: la separación se basa en el tamaño molecular. Como fase estacionaria se utilizan sustancias porosas de tamaño apropiado.

Parámetros a seguir

·         Naturaleza de la fase estacionaria

·         Interacción de la fase móvil y estacionaria

·         Tamaño de la partícula

·         Composición y flujo

·         Detector

Características de una fase móvil (solvente)

• Baja viscosidad para reducir las caídas de presión
• Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles
• Compatible con el detector utilizado
• No debe disolver la fase estacionaria
• Bajo contenido de impurezas

HPLC: Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:

Datos interesantes del Paraguay

   La industria farmacéutica paraguaya cuenta con equipamientos para el control de calidad de sus productos, incluyendo cromatógrafos de HPLC de cuarta generación, equipos pata test de disolución y otros de alta complejidad. Así también cuenta con laboratorios públicos y privados encargados del control de calidad con semejantes niveles de equipamiento y capacitación a las que las empresas nacionales que acuden para realizar sus análisis cuando no cuentan con instrumentos propios. 

Entre ellos se encuentran:

    El Instituto Nacional de Tecnología, Normalización y Metrología (INTN).

·      El Centro Multidisciplinario de Investigación Tecnológica (CEMIT), dependiente del rectorado de la Universidad Nacional de Asunción.

· El laboratorio de Control de Drogas y Medicamentos (LABCON), dependiente de la facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Asunción (realiza análisis fisicoquímicos de los medicamentos).

·    PHARMACONTROL, laboratorio privado.

          La Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción campus Alto Paraná cuenta con un HPLC en el laboratorio interno, ofreciendo un aprendizaje de calidad a sus alumnos en el área de las ciencias químicas.

Bibliografía

       D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman. Principios de Análisis Instrumental . McGraw-Hill. 5ta Edición

CROMATOGRAFÍA DE GASES

Es una técnica muy utilizada para separar compuestos volátiles de una muestra.

Pero ¿cómo funciona un cromatografo de gases?

Figura de las partes de un cromatografo de gases                     Este tipo de cromatografo es utilizada para separar y analizar compuestos químicos que pueden ser vaporizados sin riesgo a que se descompongan.

                   Las cromatografías tienen en común la característica de tener una fase móvil y una fase estacionaria para lograr la separación de las mezclas químicas complejas. En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas acarreador; los gases inertes como el helio o los gases no reactivos como el nitrógeno son frecuentemente utilizados. El helio es el gas más utilizado, pues aproximadamente el 90% de los instrumentos lo utilizan, sin embargo el hidrógeno se prefiere para mejores separaciones.  La fase estacionaria es una capa microscópica de líquido o polímero en un soporte sólido, dentro de una pieza tubular de metal o vidrio llamada columna.

                     Los compuestos gaseosos analizados interactúan con las paredes de la columna, que está revestida con la fase estacionaria. Esto causa que cada uno de los compuestos eluya a un tiempo distinto, esto se conoce como tiempo de retención del compuesto. La comparación de los tiempos de retención es lo que le da a la cromatografía de gases su utilidad analítica.

¿Sabías que... 

             Una de las ventajas de la utilización de cromatografía de gases es que se consiguen excelentes separaciones. La velocidad y la sensibilidad son extraordinarias, siendo detectables cantidades del orden de 10-12gramos para muchas sustancias. Debido a que la rapidez del revelado de los cromatogramas depende de la velocidad de difusión entre las fases móvil y estacionaria, y debido a que la velocidad de difusión de los gases es mucho mayor que la de los líquidos, el cromatograma de gases puede ser realizado unas mil veces más rápido que el equivalente en la cromatografía liquida en columna. Por consiguiente, las separaciones pueden obtenerse, con frecuencia, en menos de un minuto.

Principales limitaciones de la cromatografía de gases

           La limitación más resaltante es que solo pueden ser manipuladas muestras volátiles, pues deben estar en estado gaseoso para pasar a través de la columna. La muestra además de ser volátil debe ser térmicamente estable, es decir, no debe descomponerse a las altas temperaturas a las que estará expuesta en la columna.

          También cabe mencionar que es frecuente la necesidad de eliminar interferencias en la muestra, lo que hace que la técnica sea ineficiente para análisis cualitativos. Es difícil tratar compuestos iónicos, compuestos de elevada polaridad y compuestos de peso molecular superior a 600.

¿Cuál es su utilización en química? 

                   Puede utilizarse con cualquier sustancia que pueda volatilizarse. Por lo tanto, hay miles de compuestos orgánicos que pueden separarse con este tipo de cromatografía. Las sustancias no volátiles pueden examinarse convirtiéndolas en derivados volátiles por oxidación, acilación, alquilación u otros procesos.

               Su principal utilización con muestras biológicas es la separación de alcoholes, ésteres, ácidos grasos y aminas. Por lo tanto, es de una gran utilidad en el estudio del metabolismo intermediario y en el análisis del mecanismo de acción de las enzimas. Se ha utilizado en gran escala para identificar los componentes aromatizadores de los alimentos y vinos, como también, para la detección de pesticidas en materiales biológicos.

SHIMADZU GC-2010

Cromatografo de gases

CROMATOGRAFÍA

Inicios de la cromatografía...

Mikhail Tswett, un botánico ruso, fue el primero en utilizar esta técnica de análisis a principios del siglo XX  para separar una mezcla de pigmentos vegetales, empleando en el proceso una columna de vidrio repleta de un sólido absorbente, en donde pudo observar que las especies se separaban en distintas bandas coloreadas, dándole finalmente el nombre de cromatografía (del griego chroma que significa color y graphein, escribir).

De manera sencilla, ¿cómo podríamos definir a la cromatografía?

  Puede decirse que es una técnica de separación de mezclas complejas de especies químicas que se fundamenta en la división de dos fases: una móvil, que corresponde al fluido pudiendo ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico y la otra estacionaria que se trata de un sólido o un líquido adherido a un sólido.

  Tipos

Según la forma en que las fases móvil y estacionaria se ponen en contacto se pueden clasificar en dos tipos de cromatografía:

• Cromatografía plana: cuando la fase estacionaria se deposita sobre una superficie abierta (papel, lámina de plástico, vidrio o metal).

Las más utilizadas son:

-       - Cromatografía en papel

-       - Cromatografía en capa fina.

• Cromatografía en columna: cuando la fase estacionaria se deposita dentro de una columna (sílice fundida, vidrio, acero)

Según el fluido utilizado como fase móvil  se distinguen:

-       - Cromatografía de líquidos.

-       - Cromatografía de gases.

-       - Cromatografía de fluidos supercríticos.

Cromatografía en columna

  
  La fase móvil es líquida y transita dentro de la fase estacionaria que puede ser sólida o líquida (retenida en un compartimiento cilíndrico) siendo las más utilizadas la de sílice y alúmina, de preferencia la de sílice debido a su mayor capacidad de muestra.

Cromatografía plana

 Se utilizan la mayoría de los principios que en la cromatografía en columna. Se realiza sobre papel u otro material sólido que suele denominarse “en capa fina” o “en capa delgada”.

Aplicaciones.

-En criminología, para tomas de muestras de sangre u objetos (telas) del crimen.
-Determinación de los niveles de alcohol, drogas, sustancias tóxicas en la sangre.
-Determinación de la estructura de los alimentos.
-Determinación de los niveles de contaminación del agua o del aire.
-Para estudiar mezclas complejas como alimentos, perfumes, petroquímica, y producción farmacéutica.

Datos interesantes:

-El Paraguay cuenta con un distribuidor exclusivo, laboratorios Costanzo (LABCO ) de línea completa de insumos para la cromatografía. Para más información ingresar a: http://www.labco.com.py/index-productos.html

-La Universidad Católica del Paraguay ofrece diplomados y especializaciones en cromatografía. Para más información ingresar a: http://www.universidadcatolica.edu.py/comenzaron-diplomados-y-especializaciones.html

ESPECTROSCOPÍA RAMAN

Los inicios de la espectroscopia Raman

Chandrashekhara Venkata Raman fue un físico indio, descubridor del llamado efecto Raman en el año 1928. Este científico dio nombre al fenómeno inelástico de dispersión de la luz que permite el estudio de rotaciones y vibraciones moleculares.

Teoría de espectroscopía Raman

La espectroscopia Raman es una técnica analítica espectroscópica aplicada tanto para la química o para la física. Con este tipo de espectroscopia, se estudia modos de baja frecuencia como los vibratorios, rotatorios, y otros. La técnica presenta el fenómeno  denominado dispersión inelástica, o dispersión  Raman, de un láser de luz visible, IR cercano o UV cercano monocromática.

¿Cómo ocurre?

La luz láser interactúa con fotones u otras excitaciones en el sistema, provocando que la energía de los fotones del láser, experimenten un desplazamiento hacia arriba o hacia abajo. El desplazamiento en energía da información sobre los modos del fotón en el sistema.

Desventajas o limitaciones de la espectroscopía Raman

La espectroscopia Raman es una herramienta útil para una amplia variedad de problemas, sin embargo, no es utilizada en muestras fluorescentes ya que estos interfieren la señal Raman.

Algunas muestras fluorescentes que pueden interferir:

• La orina y el suero: son suficientemente fluorescentes como para que la SRR en estas matrices comunes en laboratorios clínicos.
• Muestras de pintura, colores fabricados o preparaciones farmacéuticas.

Otras limitaciones de menor trascendencia son:

1. Los análisis vibracionales significativos requieren de datos de sustitución isotópica extenso.
2. Los factores que determinan la extensión del aumento de resonancia de modos vibracionales discretos no son generalmente bien obtenidos (por ejemplo, algunas vibraciones pueden ser observadas debido al aumento de resonancia insignificante).
3. Son insensibles a las propiedades magnéticas de centros metálicos
4. No es útil para investigar centros metálicos no cromofóricos, como por ejemplo de Zn+2.

Aplicaciones en el área de Salud

La espectrometría Raman se utiliza comúnmente en química, ya que la información vibracional es muy específica para los enlaces químicos de las moléculas. Las fibras activas Raman, como la aramida y el carbono, tienen modos vibracionales que muestran un cambio en la frecuencia Raman con estrés aplicado. Las fibras de polipropileno también muestran cambios similares.

Los analizadores de gases Raman tienen muchas aplicaciones prácticas. Por ejemplo, se usan en medicina para el seguimiento en tiempo real de las mezclas de gases respiratorios y la anestesia durante una cirugía

La espectrometría Raman compensada espacialmente (SORS), se puede utilizar para descubrir la falsificación de medicamentos sin necesidad de abrir su embalaje interior, y para monitorización no invasiva de tejido biológico.

Instrumentación

Un sistema de espectroscopía Raman normalmente consta de cuatro componentes principales:

• Fuente de excitación (láser).
• Sistema de iluminación de la muestra.
• Selector de longitud de onda (Filtro o espectrofotómetro).
• Detector (Fotodiodos, CCD o PMT)

Espectrómetro Raman portátiles

Espectrómetro Raman

Un microscopio Raman consiste de un microscopio óptico estándar con un láser de excitación, un monocromador y un detector sensible (como un dispositivo de carga acoplada (CCD), o un tubo fotomultiplicador (PMT)).

En visualización directa, todo el campo de visión se examina por dispersión sobre una pequeña gama de números de onda (turnos Raman).

En tiempos actuales existen una infinidad de instrumentos modernos Raman, así como los portátiles que son mucho más cómodos a la hora de su empleo y se puede transportar a cualquier lugar.

Técnicas de espectroscopía Raman ayuda a distinguir con precisión células cancerosas. Reportaje.